Comenzó su carrera con papeles menores en series de televisión y telefilmes. En 1997, tuvo un papel de reparto en La tormenta de hielo, de Ang Lee y en Deconstructing Harry de Woody Allen. Ya en la década de 2000, trabajó en Wonder Boys (2000), las tres películas basadas en el cómic Spider-Man y en la candidata al Premio Óscar a la mejor película, Seabiscuit (2003). Concluida la trilogía de Spider-Man, fue aclamado por la crítica por su interpretación en Brothers (2009), donde actuó junto a Jake Gyllenhaal y Natalie Portman. Por su trabajo, recibió una nominación al Premio Globo de Oro como mejor actor dramático. En 2013, protagonizó la película El gran Gatsby junto a Leonardo DiCaprio. En 2014, interpretó al ajedrecista Bobby Fisher en la biopic Pawn Sacrifice, que también produjo. Es vegano, y en 2002 la organización Personas por el Trato Ético de los Animales lo nombró «vegano más sexy del mundo».

Maguire consolidó su carrera en 2002, al obtener el papel protagónico en el filme Spider-Man, dirigido por Sam Raimi y basado en la historieta The Amazing Spider-Man de Marvel. Dos años antes del estreno del largometraje, había firmado un contrato para aparecer en tres películas de la entrega.14​ Cobró entre tres y cuatro millones de dólares por interpretar al fotógrafo Peter Parker,​ quien se convierte en un superhéroe que lucha contra el crimen luego de ser mordido por una araña genéticamente modificada. Maguire consiguió el papel en julio de 2000,14​ y fue la primera opción de Raimi desde que vio su actuación en The Cider House Rules.​ Para prepararse para el papel, Maguire necesitó un entrenador personal, un instructor de yoga, practicó artes marciales y tomó clases de escalada.​ En una entrevista, cuando se le preguntó sobre su experiencia en la película, el actor contestó que el largometraje había sido algo muy positivo para su carrera, y que, al momento de ser aceptado para el papel, comenzó a practicar toda clase de deportes durante cinco meses e hizo artes marciales, bicicleta y kick boxing.​ Spider-Man consiguió dos nominaciones al Premio Óscar y recaudó 821,7 millones de dólares en todo el mundo, lo que la convirtió en la tercera película de mayor recaudación de 2002, solo por detrás de El Señor de los Anillos: las dos torres y Harry Potter y la cámara secreta.

Debido al éxito de Spider-Man se llevaron a cabo dos secuelas, Spider-Man 2 (2004) y Spider-Man 3 (2007), ambas grandes éxitos taquilleros. La segunda película de la saga tiene lugar dos años después de la primera, y esta vez el personaje de Maguire debe impedir que el villano, el doctor Octopus, destruya la ciudad. Durante el rodaje de Seabiscuit, que protagonizó ese mismo año, Maguire se lesionó la espalda y la productora Sony consideró sustituirlo por otro actor en la segunda entrega. Incluso, hubo negociaciones para reemplazarlo por Jake Gyllenhaal, quien en ese entonces mantenía una relación amorosa con Kirsten Dunst, la actriz que interpretó a Mary Jane Watson.​ Sin embargo, Maguire se recuperó a tiempo para retomar el papel, por el que cobró diecisiete millones de dólares.​ Cuando se le preguntó qué diferencias encontró entre la primera y segunda película, Maguire contestó que «son diferentes, pero la secuela me costó menos trabajo», pues antes de filmar debió hacer cuatro horas diarias de gimnasia, caminatas, entrenamientos con pesas y desarrollar su masa muscular seis días a la semana​ Por su actuación, ganó un Premio Saturno en la categoría mejor actor.

Spider-Man 3 se estrenó el 16 de abril de 2007 en Tokio y recaudó 890,9 millones de dólares en todo el mundo, lo que la convirtió en la película más taquillera de la trilogía. A diferencia de las dos anteriores, obtuvo críticas variadas. Luego del estreno de la tercera parte, Sony Pictures confirmó la realización de Spider-Man 4, cuya fecha de estreno estaba programada para mayo de 2011. Sin embargo, luego de muchos conflictos con el guion y la dirección, no se continuó con la historia, y en enero de 2010 se anunció la cancelación de la película y el inicio de una nueva saga con un nuevo director y elenco. En diciembre de ese mismo año comenzó la filmación del reboot The Amazing Spider-Man.

Fuera de la saga Spider-Man, Maguire protagonizó el largometraje dramático de Gary Ross Seabiscuit (2003), en el que interpretó a Red Pollard, jinete del purasangre Seabiscuit, una de las mayores leyendas de carreras de caballos. La película está basada en el libro de Laura Hillenbrand Seabiscuit: una leyenda americana. Ross ya había dirigido al actor en Pleasantville, de 1998. Maguire declaró que aceptó el papel porque «me encantó el guion. Gary Ross hizo un gran trabajo adaptándolo. Leí el libro antes que el guion y me encantó la historia [...] Mi personaje es estupendo y complejo, estaba emocionado por interpretarlo».​ Debido a que el actor debió aumentar su masa muscular para Spider-Man, tuvo que adelgazar y perder musculatura para el papel de jockey.​ La película, de la que también fue productor ejecutivo, se estrenó el 22 de julio de 2003. Recibió críticas favorables y fue candidata al Óscar a la mejor película. El elenco, por su parte, obtuvo una nominación al Premio del Sindicato de Actores en la categoría mejor reparto. En cuanto a la actuación de Maguire, Todd McCarthy, de la revista Variety, escribió: «Con su cabello rojo y su figura más delgada tras Spider-Man, Maguire interpreta a Pollard de forma convincente, sentado en la silla de montar o aconsejando a su reemplazo sobre cómo montar a Seabiscuit mientras él está hospitalizado».

En 2006, realizó un papel de reparto en la película protagonizada por George Clooney y Cate Blanchett The Good German.