Ha trabajado en teatros británicos y de Estados Unidos, tanto del West End y Broadway como del circuito alternativo. En cine participó, entre otras, en Prospero's Books, de Peter Greenaway, Intimidad, de Patrice Chéreau y Bridge of Spies, The BFG y Ready Player One, de Steven Spielberg.

Recibió, entre otros premios, dos Olivier, tres BAFTAs, dos Tonys y un Oscar a Mejor Actor de Reparto. Fue, además, ordenado Knight Bachelor en 2016.

En 1991, se unió a la junta directiva del Shakespeare's Globe, teatro del que fue director artístico entre 1995 y 2005.

Para abrir la temporada de 1996 (llamada Prologue Season), eligió Los dos hidalgos de Verona porque su principal interés era "establecer la relación entre actores y público" y, al ser una obra menos conocida, la gente se acercaría "sin preconceptos". El director Frank Shepherd hizo una puesta contemporánea, con un elenco multiétnico integrado por británicos y estadounidenses y Rylance en el papel de Proteo. La obra estuvo en cartel entre el 21 de agosto y el 15 de septiembre y, a principios del año siguiente, fue llevada al teatro New Victory de Nueva York.

El Shakespeare's Globe se inauguró finalmente en junio de 1997 con una puesta contemporánea de Cuento de invierno y un Enrique V ambientado en la época isabelina, con un elenco íntegramente masculino encabezado por Rylance y dirigido por Richard Olivier (hijo de Laurence).​ Rylance también fue el señor Allwitt en Una casta doncella de Cheapside, de Thomas Middleton. Sus siguientes trabajos, en 1998, fueron los papeles de Basanio en El mercader de Venecia, también dirigida por Olivier, aunque con un elenco mixto,​ y el de Hippolito en La puta honesta, de Middleton y Thomas Dekker.

En 2007, volvió a trabajar con Warchus en la comedia Boeing-Boeing junto a Frances de la Tour y Roger Allam en el Comedy Theatre y, en 2008, con otro elenco en el Longacre Theatre de Broadway. Por su papel de Robert, fue nominado a otro premio Olivier y recibió un Tony a Mejor Actor.

En 2008, interpretó a Tomás Bolena en The Other Boleyn Girl, película de Justin Chadwick basada en la novela homónima de Philippa Gregory.​ Al año siguiente, protagonizó Jerusalem, de Jez Butterworth, en el Royal Court Theatre, trabajo por el que ganó otro Olivier a Mejor Actor y un Evening Standard y el premio que otorga The Critics' Circle en la misma categoría. Ese mismo año, Simon McBurney, director de Complicité, lo convocó para interpretar a Hamm en Final de partida, de Samuel Beckett.​ La obra se estrenó en octubre en el Duchess Theatre.​ En 2010, nuevamente con dirección de Warchus, fue el protagonista de La Bête, comedia en versos pareados del estadounidense David Hirson. Tras su estreno en el Comedy Theatre de Londres, la obra se transfirió al Music Box Theatre de Broadway.​ Rylance también interpretó al actor Henry Condell en Anonymous, película de Roland Emmerich que aborda la teoría oxfordiana sobre la autoría de las obras de Shakespeare.​ Trabajó también en Blitz, en el papel de un policía próximo a retirarse.

Regresó al Shakespeare's Globe en julio de 2012, para interpretar nuevamente a Olivia en Noche de reyes y protagonizar Ricardo III. Ambas obras, con elenco masculino y dirigidas por Tim Carroll, pasaron en noviembre al teatro Apollo del West End y se estrenaron en Broadway al año siguiente.

En 2018, con dirección de van Kampen, fue Yago en Otello, protagonizada por André Holland.

En 2019, interpretó a Leontes en una escena de Cuento de invierno y el monólogo inicial de Ricardo III en la celebración de un nuevo aniversario del nacimiento de Shakespeare, organizada por el Globe en la Abadía de Westminster.​ Fue, además, el Magistrado en la versión cinematográfica de Esperando a los bárbaros, de J. M. Coetzee, dirigida por el colombiano Ciro Guerra. En televisión, protagonizó uno de los capítulos de My Grandparents War, documental de Channel 4 que sigue a distintas personas públicas mientras investigan sobre la participación de sus abuelos en la Segunda Guerra Mundial.

En 2020, interpretó al abogado William Kunstler en El juicio de los 7 de Chicago, película escrita y dirigida por Aaron Sorkin que narra el juicio de los Chicago Seven, grupo opositor a la guerra de Vietman.​ Al año siguiente, fue Peter Ishelwell, un empresario de telecomunicaciones, en Don't Look Up, película de Adam McKay.