Saltó a la fama en 2013 con su papel como Patsey en la película 12 años de esclavitud, del director británico Steve Rodney McQueen, por la que fue aclamada por la crítica. Protagonizó, junto a Chadwick Boseman, a Nakia en Black Panther del Universo Cinematográfico de Marvel en el 2018.

Ganó el Óscar a la mejor actriz de reparto y el Premio SAG a la mejor actriz de reparto, y fue nominada al Globo de Oro a la mejor actriz de reparto y al BAFTA a la mejor actriz de reparto por 12 años de esclavitud, entre otros premios internacionales.

Inmediatamente tras graduarse de Yale, Nyong'o fue seleccionada para participar en el filme 12 Años de Esclavitud, del cineasta británico Steve Rodney McQueen. El filme, estrenado en 2013, fue aclamado por la crítica. Gracias a esto, recibió nominaciones a diversos premios como el Globo de Oro a la mejor actriz de reparto y dos nominaciones a los premios SAG, incluyendo el premio SAG a la mejor actriz de reparto.​ Nyong'o participó en el filme de Liam Neeson: Non-Stop.

En 2014 fue seleccionada como uno de los rostros de la campaña de verano de Miu Miu, al lado de Elizabeth Olsen, Elle Fanning y Bella Heathcote.

El 23 de abril de 2014 fue seleccionada por la revista People como la mujer más linda del mundo y quedó por encima de otras 50 elegidas.

El 16 de febrero de 2018 hizo su primera aparición en el universo cinematográfico de Marvel en la película Black Panther, interpretando al personaje de Nakia.

En 2019 publicó su libro Sulwe, que aborda el tema del racismo, particularmente el colorismo, contando la historia de una niña de piel oscura que deseaba que su piel fuera más clara. Netflix anunció en 2021 que realizará una película de animación musicalizada basada en la obra, con textos de Lupita Nyong’o, quien es la productora; y con ilustraciones de Vashti Harrison.