Sudeikis comenzó a actuar en ComedySportz (ahora Comedy City) en Kansas City. Después de mudarse a Chicago, Sudeikis estudió en el Annoyance Theatre y ImprovOlympic, donde fue uno de los miembros fundadores del equipo de larga duración J.T.S. Brown. Más tarde fue elegido en la Compañía Nacional de Turismo de la Segunda Ciudad, y también actuó con Boom Chicago en Ámsterdam. A principios de 2000, se convirtió en miembro fundador de Second City Las Vegas.

En 2003, mientras realizaba una performance en Second City Las Vegas, Sudeikis fue contratado como escritor de Saturday Night Live, e hizo ocasionalmente apariciones como miembro de la audiencia o suplementos. En mayo de 2005, se convirtió en un miembro destacado en el show, y fue ascendido a estado de repertorio al comienzo de la temporada 32 del show el 30 de septiembre de 2006. En julio de 2013, Sudeikis anunció que dejaba Saturday Night Live.

Sudeikis tuvo un rol recurrente en la serie de la NBC 30 Rock con su amiga Tina Fey a principios de 2007, apareciendo en un total de siete episodios. Actuó como Floyd DeBarber, un amor del personaje de Tina Fey, Liz Lemon. Hizo otra aparición como Floyd en un episodio de 2008, y volvió a aparecer en el episodio del Día de San Valentín que se transmitió el 11 de febrero de 2010, junto con Jon Hamm y Dean Winters. Sudeikis apareció por última vez en tres episodios hacia el final de la cuarta temporada de la serie en 2010. Sudeikis hizo el trabajo de voz para el videojuego Grand Theft Auto IV, interpretando el papel del radio de derecha Richard Bastion.

Tuvo una aparición en la comedia de 2008 What Happens in Vegas, interpretando el papel del exnovio de Cameron Diaz. En julio de 2008, Sudeikis fue coprotagonista junto a Bill Hader y Joe Lo Truglio en la serie web producida por Lorne Michaels The Line on Crackle. También apareció en la película The Bounty Hunter, lanzado en marzo de 2010.

Sudeikis fue un actor de voz en la serie de comedia animada de FOX The Cleveland Show donde proporcionó la voz a Holt Richter, el vecino de moda de Cleveland, así como la voz de Terry Kimple, el compañero de Cleveland, que ahora trabaja con Cleveland en la compañía de cable. Después de ser acreditado como un invitado recurrente en la primera temporada, Sudeikis fue golpeado hasta un comienzo de serie regular en la segunda temporada.

En mayo de 2010, Sudeikis se unió al elenco de la comedia de Seth Gordon Horrible Bosses, que también protagonizó Jamie Foxx, Kevin Spacey, Jennifer Aniston, Colin Farrell, Charlie Day y Jason Bateman.

Sudeikis correcibió WWE Raw con Going the Distance coprotagoniza Charlie Day y Justin Long el 16 de agosto de 2010, en el Staples Center en Los Ángeles. También actuó en su primer papel principal en una película, junto con Owen Wilson, Pase Libre de los hermanos Farrelly en 2011. Ya había trabajado con Day cuando interpretó el papel de Schmitty en It's Always Sunny in Philadelphia, y volvió a interpretar el papel en la séptima temporada de la serie.

Fue anfitrión de los premios MTV Movie Awards el 5 de junio de 2011, en el anfiteatro de Gibson.

En 2012, tuvo un papel recurrente en la tercera temporada de la serie de HBO Eastbound & Down interpretando a Shane, compañero de batería de Kenny Powers en Myrtle Beach Mermen y al hermano gemelo de Shane, Cole.

Sudeikis se convirtió en la voz para una línea de anuncios de la cadena de comedor informal Applebee que comenzó a correr en 2012.

Sudeikis aparece en el videoclip de la canción "Hopeless Wanderer" del grupo británico Mumford & Sons, interpretando al vocalista principal del grupo (Marcus Mumford).

Sudeikis también ha interpretado a Ted Lasso, un desafortunado entrenador de fútbol americano traído a Inglaterra para entrenar al Tottenham Hotspur Football Club, como parte de dos vídeos promocionales para NBC Sports en 2013 y 2014 para su cobertura de la Premier League. La idea fue posteriormente adaptada a una serie de Apple TV+ titulada Ted Lasso, protagonizada por Sudeikis.