Alcanzó la fama después de participar en varias producciones cinematográficas en la década de los noventa, entre las que se destacan The Devil's Advocate (1997), Mighty Joe Young (1998) y The Cider House Rules (1999). En 2003 fue acreedora del Óscar a la mejor actriz por su interpretación de la asesina en serie Aileen Wuornos en la película Monster, lo que la convirtió en la primera africana en recibir el premio en esa categoría. Dos años después recibió por segunda vez una nominación al Óscar por su actuación en North Country. Desde 2007 Theron es ciudadana estadounidense, aunque aún conserva su ciudadanía sudafricana.

En 2003, protagonizó el drama Monster, dirigida por Patty Jenkins y basada en la vida de Aileen Wuornos, una prostituta de Daytona Beach que se convirtió en asesina en serie. Charlize Theron encarnó a Aileen, y Christina Ricci interpretó el papel de Selby, una mujer con la cual Wuornos mantuvo una relación entre los años 1989 y 1990, período en el que se centra la película. Por este trabajo, consiguió el reconocimiento de la crítica y del público a nivel mundial, además de recibir, entre otros, el Premio a la Mejor Actriz del Sindicato de Actores, un Globo de Oro como mejor actriz en un papel protagonista en película dramática, y un Óscar como mejor actriz en un papel protagonista.

En 2004, participó en la película para TV de la cadena HBO (The Life and Death of Peter Sellers), que le valió otra nominación a los Globos de Oro. Al año siguiente, interpretó el papel protagonista en Æon Flux, una película de ciencia ficción ambientada en el futuro, basada en los cortos animados de la cadena de televisión MTV.​ Por otra parte, el mismo año, protagonizó North Country, junto a Frances McDormand.​ Por este trabajo, la actriz fue candidata nuevamente a los Premios Globo de Oro y Óscar como Mejor Actriz.

Durante el 2008 y 2010, coprotagonizó junto a Will Smith la película del superhéroe Hancock donde interpretó a Mary, esposa de Ray, fue una de las maestras de ceremonia del sorteo de la Copa Mundial de Fútbol de 2010,​ y tuvo un papel en el vídeo musical «Crossfire», sencillo del primer disco en solitario de Brandon Flowers, en el cual aparece rescatando a este último de las manos de unos ninjas.​ En 2012 protagonizó junto a Kristen Stewart Snow White & the Huntsman, ese mismo año trabajó bajo las órdenes de Ridley Scott en Prometheus.

El 6 de abril de 2017 iba a aparecer en el programa de televisión El hormiguero junto a Vin Diesel, pero debido a que le había surgido un compromiso, tuvo que volver a Estados Unidos y cancelar todos sus planes para el preestreno de The Fate of the Furious.